mielec pisarka ad

Po odwirowaniu przy 700 xg przez 15 minut w 4 ° C, wysepki zebrano z 11% -20,5% roztworu Ficoll z plastikową pipetą. Ficoll usunięto przez przemycie wysepek HBSS zawierającym 0,5% bydlęcej albuminy surowicy i wirowanie przy 700 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Od 5000 do 8000 wysepek rutynowo uzyskano od 20 szczurów. Oczyszczone wysepki ponownie zawieszono w HBSS, który był wolny od wapnia i magnezu i zawierał 3 mM eter bis (.aminoetyloeteru) -N, N, N, N -tetraoctowego glikolu etylenowego i inkubowano w 37 ° C przez 15 minut. Podczas inkubacji wysepki delikatnie aspirowano i uwalniano z plastikowej pipety. Ta procedura dała zawiesiny w dużej mierze złożone z pojedynczych komórek z kilkoma agregatami złożonymi z trzech do pięciu komórek. Badanie wychwytu dioctanu fluoresceiny 6 wykazało, że średnia (. SE) wynosząca 70 . 5 procent komórek była żywa.
Pomiar Uptake
Zdyspergowane komórki z 3500 wysepek inkubowano w 0,7 ml roztworu IgG zawierającego końcowe stężenie 2 mM [14C] mocznika (0,5 .Ci na mikromol) jako znacznik przestrzeni wewnątrzkomórkowej w 37 ° C przez 20 minut, a następnie inkubowano w 15 ° C. ° C przez 10 minut. Wychwyt analogów glukozy oznaczono zgodnie z metodą Gorusa i wsp.7. Dla 3-O-metylo-.-D-glukozy, 50 .l M D-glukozy zawierającej 10 mM EDTA i 0,1% dodecyl sodowy siarczan (pH 8,0) umieszczono na dnie 400 .l probówek mikrofugowych. Na ten roztwór nałożono 150 .l mieszaniny ftalan dibutylo-fenylo-dinonyl (4: 1). Po 30-sekundowym odwirowaniu w mikrowirówce Beckman, 50 .l soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 2 mM [14C] mocznika (0,5 .Ci na mikromol) i 20 mM 3-0-.-D- [3H] metylo-glukopiranozydu (5 .Ci na mikromol) nałożono na warstwę ftalanu dibutylu-dinonylu. Następnie probówki inkubowano przez 20 minut w 15 ° C. Pobranie rozpoczęto przez dodanie 50 .l zawiesiny komórek inkubowanej z mocznikiem do 50 .l fosforanowej fazy fizjologicznej buforowanej zawierającej znakowany analog glukozy i mocznik. Pobranie zakończono przez odwirowanie komórek przez 15 sekund, tak że przeszły one przez ftalan dibutylo-fenylo-dinonylowy do M roztworu glukozo 10 mM EDTA0,1% dodecylosiarczanu sodu. Następnie z każdej probówki usunięto 50 .l supernatantu w celu obliczenia aktywności właściwej i usunięto 35 .l M D-glukozy zawierającej 10 mM EDTA i 0,1% dodecylosiarczanu sodu do oznaczenia wychwytu w urządzeniu Beckman LS 5801 ciekły licznik scyntylacyjny. Wychwyt mierzono w dwóch powtórzeniach w czasie wskazanym w każdym eksperymencie. Wyniki obliczano jako rozpady każdego izotopu na minutę za pomocą rezydualnego programu obliczeniowego licznika i wyrażano w milimolach na litr przestrzeni wysepek. Korekcje dla przestrzeni pozakomórkowej, jak oceniono na podstawie pomiaru L-glukozy w czasie zero, wynosiły 19, 22 i 28 procent całkowitej ilości mocznika w doświadczeniach przeprowadzonych w samym buforze, buforze zawierającym IgG od zdrowych osobników i buforze zawierającym IgG od pacjentów z IDDM, odpowiednio. Podczas inkubacji obecnych było około 103 komórek wysp trzustkowych na miligram IgG
[podobne: dyskopatia objawy, fasolka po bretońsku kalorie, dysfonia ]